[Méthode et matériaux]

Ėtape 1 : La conception des siARN

 1)      Analyse de la séquence protéique et de l’ADN des isomères alpha Na+, K+ ATPase et identification de régions divergentes.

2)      Sélection des séquences nucléotidiques des siARN.

·        Satisfaire les critères établis préalablement

3)      Insertion de la séquence siARN dans un shARN et commande des amorces.

·        Ajout des sites de reconnaissance EcoRI and BamHI

·        Ajout du site de restriction MluI

4)  Agencement des brins sens et anti-sens.  

 5)      Ligature du double brin dans un vecteur ARNi pSIREN-shuttle comportant une séquence promoteur U6 en amont de la séquence insérée.  

6)      Amplification de la séquence insérée par PCR (Réaction polymérisation en chaîne).  

7)      Digestion selon le site de restriction Mlu I.

8)      Confirmation de la ligature du siARN dans le vecteur par électrophorèse.

Ėtape 2 : Transfection passagère des siARN dans les cellules NG108-15